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基因分型技术新突破:Allegro靶向基因分型技术详

基因分型技术新突破:Allegro靶向基因分型技术详

作者:admin    来源:未知    发布时间:2020-09-04 14:59    浏览量:

参数说明

基因分型(Genotyping)是利用分(fen)子生物(wu)(wu)学(xue)(xue)方法检测生物(wu)(wu)个(ge)体基(ji)因(yin)型的技(ji)术,在医学(xue)(xue)和农业(ye)(ye)生产(chan)中(zhong),具有广泛(fan)的应用价值:在农业(ye)(ye)领域,常用于(yu)进行形(xing)状基(ji)因(yin)的精细定(ding)位(wei)、分(fen)子辅助育种(zhong)(zhong)、种(zhong)(zhong)质资源鉴定(ding)等(deng)等(deng);医学(xue)(xue)领域常用于(yu)分(fen)析诊断疾(ji)病导致的遗传变(bian)异,分(fen)子遗传机制(zhi)、易感(gan)性(xing)位(wei)点筛选(xuan)及药物(wu)(wu)敏感(gan)位(wei)点筛选(xuan)等(deng)。

目前(qian)常(chang)用的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)分(fen)型手(shou)段主要(yao)是基(ji)(ji)(ji)(ji)于NGS的(de)(de)(de)简化(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)组(zu)方(fang)法,包括GBS、RAD、ddRAD等,这(zhei)些简化(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)组(zu)方(fang)法都能够提供(gong)开放、无偏差的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)分(fen)型,但却(que)没有一种技术可(ke)以(yi)实(shi)现针(zhen)对靶(ba)向基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)区的(de)(de)(de)高效分(fen)型——单(dan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)、基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家族(zu)、启动子和增强(qiang)子、基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)簇及非编码基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)等都可(ke)能含有重要(yao)的(de)(de)(de)与表型变(bian)异(yi)密切相关的(de)(de)(de)多(duo)态(tai)性。因(yin)(yin)(yin)为传统的(de)(de)(de)简化(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)组(zu)技术,由于其以(yi)随机的(de)(de)(de)方(fang)式研究遗传变(bian)异(yi),获取的(de)(de)(de)信息大部分(fen)在这(zhei)些区域(yu)之外(wai),就导致(zhi)了有价值(zhi)标记的(de)(de)(de)检(jian)测缺失。虽然经典的(de)(de)(de)微阵列(lie)的(de)(de)(de)方(fang)法可(ke)以(yi)规避这(zhei)一缺漏,但却(que)存(cun)在着当基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)池改变(bian)时会(hui)出现较强(qiang)的(de)(de)(de)检(jian)测偏差和较差的(de)(de)(de)可(ke)重复(fu)性问(wen)题(ti)。

让我们来了(le)解一种两全其美的新方法:

Allegro靶(ba)(ba)向(xiang)基(ji)因分型,提(ti)供了一种(zhong)快速(su)、可(ke)扩展(zhan)、高效经济的(de)单引物富(fu)集技术(shu)(SPET),基(ji)于新(xin)一代测(ce)(ce)(ce)序(xu)技术(shu)对各(ge)类(lei)生物样本(ben)的(de)特异(yi)性(xing)靶(ba)(ba)向(xiang)区域SNP进(jin)行有针对性(xing)的(de)测(ce)(ce)(ce)序(xu)分型。该方法可(ke)以(yi)通过捕获(huo)每(mei)个靶(ba)(ba)向(xiang)测(ce)(ce)(ce)序(xu)序(xu)列的(de)SNP特异(yi)性(xing)数(shu)据(ju)点(dian),提(ti)供丰富(fu)有效的(de)测(ce)(ce)(ce)序(xu)数(shu)据(ju),不仅(jin)有效获(huo)得靶(ba)(ba)向(xiang)区分型结果(guo),更可(ke)以(yi)快速(su)构建具有可(ke)扩展(zhan)性(xing)及低成本(ben)单SNP位(wei)点(dian)检测(ce)(ce)(ce)流程。

 

技术流程如(ru)下(xia):

1. 将(jiang)基因组酶切(qie)打断,该步骤操作便捷,可实(shi)现(xian)自动化;

2. 将(jiang)片段化的基因组接(jie)上indexed adaptor ,DimerFree技术可(ke)消除接(jie)头二聚体(ti)的形成;

3. 针对靶向区域设计的(de)探针捕获目标区域捕获;

4. 扩增后获得靶向区域序列文库,测序后得到分型结果。

Allegro靶向基因分型通过探针设计及“鸡尾酒”式的酶切组合进行基因组片段化,能够有效地将SNP控制在测序读长范围内,辅以优化过的探针设计,确保SNP可通过单端测序测序模式检出。退火位点的设计也规避了已知多态性位点的位置,以确保扩增过程不会因此而造成偏倚。如果选择双端测序测序,还可在read 2中获得新的未知多态性位点信息,充实研究结果(下图)。

Allegro靶(ba)向基因分型的优势如下:

  • 方便在自动(dong)化工作站(zhan)上建库(ku)

  • 设计灵活

  • 可扩展复用

  • 检测(ce)精(jing)准(zhun)

  • 集成了(le)酶(mei)促(cu)打断

  • 低起始(shi)量(liang)(10 – 1100 ng)

  • 高(gao)检测通(tong)量(liang)(100 – >100,000 SNPs)

  • 建库周期短(<24 h)

 

截至目前,已有包括人,动物,植物在内的多个物种开展了基于SPET技术的基因分型。

今天跟大家分享的(de)是该技(ji)术在黑杨及玉米(mi)的(de)研究中的(de)应用实例:

为了评估(gu)SPET技术的(de)分(fen)(fen)型(xing)效果及(ji)(ji)技术性能(neng),研(yan)(yan)究(jiu)对10个玉米株(zhu)系(5个近交系 F7, H99, HP301, Mo17, W153R; 5个杂交F1:A632XB73, B73XF7, W153RXHP301, B73XB96, B73XMo17)同(tong)时(shi)开展(zhan)了基于illumina MaizeSNP50芯片分(fen)(fen)型(xing)的(de)研(yan)(yan)究(jiu)和SPET分(fen)(fen)型(xing),并对540株(zhu)黑杨(yang)构成的(de)自然(ran)群体(ti)进行SPET分(fen)(fen)型(xing)及(ji)(ji)Panel分(fen)(fen)型(xing)研(yan)(yan)究(jiu),以获(huo)得与生物量表型(xing)相关的(de)位点信(xin)息。

 

玉米研究中发现,全部样本中目标位点的覆盖度十分相似(约50×,下图A),通过提高覆盖度阈值,检测的准确性有改善,在50×到达的平台期后,准确率可达97.2%(下图B)。分析结果比较显示,无论在精确度和可重复性方面,自交系个体都比杂交系个体呈现更好的结果(下图C、D)

针对黑杨(yang)的大规模(mo)基因分型(xing)研究中,采(cai)用SPET技(ji)术,靶(ba)向实现(xian)(xian)了目(mu)标(biao)(biao)区(qu)域(yu)的捕获分型(xing),共捕获靶(ba)向位(wei)(wei)(wei)点数(shu)66922个,并且在非靶(ba)向区(qu)域(yu)内获得了453170个非靶(ba)向多态(tai)性位(wei)(wei)(wei)点。等位(wei)(wei)(wei)基因频率(lv)研究发现(xian)(xian),目(mu)标(biao)(biao)区(qu)域(yu)位(wei)(wei)(wei)点等位(wei)(wei)(wei)基因频率(lv)在一定(ding)程度(du)上(shang)与应用的选(xuan)择(ze)标(biao)(biao)准有关(下图),de novo方法(fa)侧重极高(gao)或极低的等位基因(yin)频率。

对不同方法获得的SNP分(fen)型(xing)结果进行样本间(jian)聚类,发现de novo方(fang)法可(ke)增(zeng)强样本群(qun)体间(jian)聚(ju)类的性能,更好(hao)的体现出差异性类群(qun)。(下图)

综上(shang),Allegro靶(ba)向基(ji)因(yin)(yin)分(fen)型的(de)SPET专利(li)技术一次性(xing)(xing)突破了(le)旧(jiu)基(ji)因(yin)(yin)分(fen)型技术的(de)瓶颈,将靶(ba)向捕(bu)获研究与可(ke)拓展(zhan)性(xing)(xing)的(de)简(jian)化基(ji)因(yin)(yin)组相结(jie)合,是一种可(ke)靠高(gao)效(xiao)低成本的(de)基(ji)因(yin)(yin)分(fen)型技术流(liu)程(cheng)。在实现了(le)可(ke)拓展(zhan)研究的(de)同(tong)时(shi),极大(da)缩减(jian)了(le)实验耗时(shi)。这些(xie)优势极大(da)弥补了(le)此前微阵列技术和简(jian)化基(ji)因(yin)(yin)组技术的(de)不(bu)足,为大(da)规模群体(ti)的(de)稳定靶(ba)向基(ji)因(yin)(yin)分(fen)型提供(gong)了(le)具有高(gao)性(xing)(xing)价比的(de)技术手段。
 

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